microspia confocale

Teoria

Fonte: Wikipedia, Microscopio Confcale 

“Il microscopio confocale è un microscopio ottico, uno strumento scientifico che si basa su una tecnologia volta ad accrescere sensibilmente la risoluzione spaziale del campione, eliminando gli aloni dovuti alla luce diffusa dai piani fuori fuoco del preparato. Lo strumento opera nel campo convenzionale degli ingrandimenti della normale microscopia ottica, ed è schematicamente costituito da un normale microscopio a trasmissione a cui viene sovrapposto un apparato che si occupa di illuminare e rilevare l’immagine di un campione illuminato con una scansione punto a punto.

microscopio confocale in riflessione

Struttura schematica essenziale di un microscopio confocale in riflessione; per semplicità è stato omesso l’oculare, posizionando il rivelatore nel punto di formazione dell’immagine intermedia.

Esistono diverse tecniche per ottenere questo risultato: a disco rotante (Nipkow disk), Programmable Array Microscopes (PAM), e laser. Quest’ultimo tipo, il più diffuso e denominato CLSM, acronimo di Confocal Laser Scanning Microscope, è un evoluto microscopio a fluorescenza che permette di focalizzare con estrema precisione un laser sul preparato, aumentando notevolmente la risoluzione e la profondità di campo. La sua sorgente luminosa è costituita da uno o più laser, generalmente a semiconduttore, per ogni diversa frequenza di eccitazione richiesta. Il meccanismo di direzione del fascio luminoso viene gestito da sistemi computerizzati.

Le immagini ottenute, sincronizzando col fascio di eccitazione il dispositivo di rivelazione, sono particolarmente definite e spettacolari, e possono permettere di evidenziare con differenti colori le diverse molecole presenti nel preparato, permettendo di apprezzarne la tridimensionalità (esempio particolarmente apprezzabile in campo biologico, utilizzando tecniche di immunofluorescenza, la fotomicrografia a lato con actina in rosso, tubulina del citoscheletro in verde e DNA del nucleo in blu).

Il metodo di formazione dell’immagine in un microscopio confocale differisce da quello di un microscopio composto convenzionale per il fatto che, mentre nel secondo il fascio di illuminazione investe l’intero campione e forma istantaneamente l’immagine sul rivelatore, nel primo la luce proveniente dalla sorgente illumina l’oggetto un solo punto per volta ed è necessaria una scansione per formare l’immagine finale. L’uso di questa tecnica permette di raggiungere risoluzioni assiali molto ridotte. Infatti un’immagine così ottenuta viene comunemente chiamata “sezione ottica”, in riferimento al fatto che è possibile indagare il campione nelle tre dimensioni spaziali con un metodo non invasivo.

Struttura schematica essenziale di un microscopio confocale in riflessione; per semplicità è stato omesso l’oculare, posizionando il rivelatore nel punto di formazione dell’immagine intermedia.

In microscopia confocale lo spot di luce puntiforme è prodotto da un pinhole posto davanti alla sorgente, ossia in sostituzione del diaframma di campo, che risulta così fisso è molto ridotto. La luce viene poi focalizzata dal collettore e dal condensatore (o dall’obiettivo, nel caso di configurazione in luce riflessa) sul campione, per poi essere raccolta dall’obiettivo e dall’eventuale oculare e focalizzata su un secondo pinhole. In corrispondenza di questo è presente anche il rivelatore d’immagine, che produce un segnale proporzionale all’intensità della luce che lo colpisce. Il pinhole di illuminazione e quello di rivelazione appartengono a piani focali coniugati e si dicono dunque confocali, da cui il nome di questa particolare tecnica microscopica.”

MICROSCOPIA CONFOCALE A DOPPIA SCANSIONE

La tecnologia Re-scan Confocal Microscopy (RCM) fornita da Confocal NL costituisce un grande passo in avanti nella possibilità di ogni Istituto di fornirsi di un Microscopio Confocale.

microscopio confocale RCMIl concetto, da intendersi come un’ aggiunta ad un microscopio scientifico già presente nel laboratorio di destinazione, consente di perseguire un solido imaging confocale con caratteristiche superiori in termini di contrasto, risoluzione ed efficienza. Il modulo ottico, connesso semplicemente attraverso un passo C fra la camera ed il microscopio ottico, contiene due unità di scansione per il percorso del fascio laser (differentemente dalla unica unità che caratterizza i Confocali standard).

La prima unità scansiona il fascio di eccitazione attraverso il campione e direziona l’ emissione di fuorescenza attraverso il pinhole, come in ogni tecnica di microscopia confocale di base. Ma a differenza di quest’ ultima il percorso ottico non finisce dietro il pinhole con un detector, ma continua verso la seconda unità di scansione che proietta l’ immagine su di una telecamera. In questo modo si aggiunge un fattore di magnificazione al sistema duplicando la velocità della seconda unità di scansione e si aumenta la risoluzione fino ad un fattore 2, superando di fatto la legge di diffrazione di Abbe senza artifatti software e senza sacrificare il contrasto.

Un ulteriore vantaggio si ha nell’utilizzo di una moderna telecamera sCMOS nella detection, essa infatti ha una efficienza quantica tipicamente doppia rispetto ai classici fotomoltiplicatori, questo si ripercuote in un’ aumento del rapporto segnale rumore di un fattore 4 se paragoniamo quello dell’ RCM a quello dei Microscopi Confocali standard.