Biofotonica - The Wizard Tecnology

Microscopio Confocale CONFOCAL.NL

La Confocal.nl è una Società Olandese nata come spin off dell' Università di Amsterdam al fine di costruire e commercializzare uno Microscopio confocale innovativo dal punto di vista tecnologico e di costo inferiore all' attuale proposta di mercato. Lo strumento da loro ideato si chiama RCM, acronimo di "Re-scan Confocal Microscopy", quindi già dal nome si evincono le caratteristiche lo distinguono dai più classici Microscopi Confocali.

MICROSCOPIA CONFOCALE: TEORIA

Il microscopio confocale è un microscopio ottico, uno strumento scientifico che si basa su una tecnologia volta ad accrescere sensibilmente la risoluzione spaziale del campione, eliminando gli aloni dovuti alla luce diffusa dai piani fuori fuoco del preparato. Lo strumento opera nel campo convenzionale degli ingrandimenti della normale microscopia ottica, ed è schematicamente costituito da un normale microscopio a trasmissione a cui viene sovrapposto un apparato che si occupa di illuminare e rilevare l'immagine di un campione illuminato con una scansione punto a punto.

Esistono diverse tecniche per ottenere questo risultato: a disco rotante (Nipkow disk), Programmable Array Microscopes (PAM), e laser. Quest'ultimo tipo, il più diffuso e denominato CLSM, acronimo di Confocal Laser Scanning Microscope, è un evoluto microscopio a fluorescenza che permette di focalizzare con estrema precisione un laser sul preparato, aumentando notevolmente la risoluzione e la profondità di campo. La sua sorgente luminosa è costituita da uno o più laser, generalmente a semiconduttore, per ogni diversa frequenza di eccitazione richiesta. Il meccanismo di direzione del fascio luminoso viene gestito da sistemi computerizzati. Le immagini ottenute, sincronizzando col fascio di eccitazione il dispositivo di rivelazione, sono particolarmente definite e spettacolari, e possono permettere di evidenziare con differenti colori le diverse molecole presenti nel preparato, permettendo di apprezzarne la tridimensionalità (esempio particolarmente apprezzabile in campo biologico, utilizzando tecniche di immunofluorescenza, la fotomicrografia a lato con actina in rosso, tubulina del citoscheletro in verde e DNA del nucleo in blu).

Il metodo di formazione dell'immagine in un microscopio confocale differisce da quello di un microscopio composto convenzionale per il fatto che, mentre nel secondo il fascio di illuminazione investe l'intero campione e forma istantaneamente l'immagine sul rivelatore, nel primo la luce proveniente dalla sorgente illumina l'oggetto un solo punto per volta ed è necessaria una scansione per formare l'immagine finale. L'uso di questa tecnica permette di raggiungere risoluzioni assiali molto ridotte. Infatti un'immagine così ottenuta viene comunemente chiamata “sezione ottica”, in riferimento al fatto che è possibile indagare il campione nelle tre dimensioni spaziali con un metodo non invasivo.

schema di un microscopio confocale in riflessione
Struttura schematica essenziale di un microscopio confocale in riflessione; per semplicità è stato omesso l’oculare, posizionando il rivelatore nel punto di formazione dell’immagine intermedia.

In microscopia confocale lo spot di luce puntiforme è prodotto da un pinhole posto davanti alla sorgente, ossia in sostituzione del diaframma di campo, che risulta così fisso è molto ridotto. La luce viene poi focalizzata dal collettore e dal condensatore (o dall'obiettivo, nel caso di configurazione in luce riflessa) sul campione, per poi essere raccolta dall'obiettivo e dall'eventuale oculare e focalizzata su un secondo pinhole. In corrispondenza di questo è presente anche il rivelatore d'immagine, che produce un segnale proporzionale all'intensità della luce che lo colpisce. Il pinhole di illuminazione e quello di rivelazione appartengono a piani focali coniugati e si dicono dunque confocali, da cui il nome di questa particolare tecnica microscopica.

Fonte: Wikipedia, Microscopio Confcale

MICROSCOPIA CONFOCALE A DOPPIA SCANSIONE

La tecnologia Re-scan Confocal Microscopy (RCM) fornita dacostituisce un grande passo in avanti nella possibilità di ogni Istituto di fornirsi di un Microscopio Confocale. Il concetto, da intendersi come un' aggiunta ad un microscopio scientifico già presente nel laboratorio di destinazione, consente di perseguire un solido imaging confocale con caratteristiche superiori in termini di contrasto, risoluzione ed efficienza. Il modulo ottico, connesso semplicemente attraverso un passo C fra la camera ed il microscopio ottico, contiene due unità di scansione per il percorso dela fascio laser (differentemente dalla unica unità che caratterizza i Confocali standard).

La prima unità scansiona il fascio di eccitazione attraverso il campione e direziona l' emissione di fuorescenza attraverso il pinhole, come in ogni tecnica di microscopia confocale di base. Ma adifferenza di quest' ultima il percorso ottico non finisce dietro il pinhole con un detector, ma continua verso la seconda unità di scansione che proietta l' immagine su di una telecamera. In questo modo si aggiunge un fattore di magnificazione al sistema duplicando la velocità della seconda unità di scansione e si aumenta la risoluzione fino ad un fattore 2, superando di fatto la legge di diffrazione di Abbe senza artifatti software e senza sacrificare il contrasto.

microscopio-confocale-RCM

Un ulteriore vantaggio si ha nell' utilizzo di una moderna telecamera sCMOS nella detection, essa infatti ha una efficienza quantica tipicamente doppia rispetto ai classici Fotomoltiplicatori, questo si ripercuote in un' aumento del rapporto segnale rumore di un fattore 4 se paragoniamo quello dell' RCM a quello dei Microscopi Confocali standard.

Video Funzionamento

SPECIFICHE TECNICHE ed OPZIONI:

RISOLUZIONE: La risoluzione ottica standard dell' RCM è 170nm a 488 nm di lunghezza d' onda. Questa è quella che viene chiamata superrisoluzione, ottenuta dal RCM senza processare l'immagine, in caso si persegua comunque un processamento si riesce ad ottenere una risoluzione pari a 140nm.

FRAME RATE: Il frame rate dell' RCM è 1 fps a 512 x 512 pixels, come conseguenza di ottengono immagini a tre colori in circa 3 secondi. Per poter comunque risolvere alcune applicazioni ove sia richiesta una maggior velocità di acquisizione è comunque possibile riprogrammare in tal senso le modalità di scansione.

microscopio-confocale-RCM
microscopio-confocale-RCM

RCM Visible

  • Risoluzione assiale: 500 nm (con eccitazione a 488 nm)
  • Risoluzione laterale: 170 nm (FWHM a 488 nm)
  • Efficienza Quantica: 80-95 % (dipende dalla camera usata)
  • Velocità di scansione: tipica 1 fps con 512 x 512 pixels.
  • Lunghezza d' onda di eccitazione: fino a 4 lasers (i.e. 405nm, 488nm, 561nm, 632 nm)
  • Lunghezza d' onda di emissione: fino a 4 bande

RCM-NIR

  • Risoluzione assiale: 770 nm (con eccitazione a 785 nm)
  • Risoluzione laterale: 240 nm (con eccitazione a 785 nm)
  • Efficienza Quantica: 80-95 % (dipende dalla camera usata)
  • Velocità di scansione: tipica 1 fps con 512 x 512 pixels.
  • Lunghezza d' onda di eccitazione: 785nm tipica, altri laser disponibili su richiesta
IPSC Neuron MAP2 LIMPII Jeroen
IPSC neuron, MAP2 and LIMPII staining. Image by Jeroen Kole (VU University Medical Center/Confocal.nl), sample prepared by Sonia Vasquez (VU University).
HUVECS actin integrin Jeroen
DNA, actin and integrin staining in HUVEC cells. Image by Jeroen Kole (VU University Medical Center).
N1E 115 neuroblastoma cells
N1E-115 neuroblastoma cells, made during HOLM 2017 by the students attending one of the workshops. On the left, raw image from RCM, on the right the same image after the Microvolution deconvolution.
Regular confocal vs RCM
Cultured cells with GFP labelled actin. Regular confocal (left) and RCM (right). A proof that Re-Scan technology can optically improve the real-time lateral resolution compared to regular confocal. Images by Christiaan Zeelenberg (University of Amsterdam).
mitotische cel rcm deconv
Mitotic cell – Cos7 cell line with antibody labeling of nucleus (blue), mitochondria (green), and tubulin (red). Samples prepared by Jana Doehner (University of Zurich). Images taken by Stan Hilt (Confocal.nl) during the BioImaging meeting Utrecht. Original RCM image (left), and the result of Microvolution deconvolution (right).
jana doehner
Cos7 cells with antibody labeling of nucleus (blue), mitochondria (green), and tubulin (red). Samples prepared by Jana Doehner (University of Zurich). Images by Irene Stellingwerf (Confocal.nl)
actin Kees-Jalink Leila-Nahidi
Cultured cell with actin labeling. By Kees Jalink & Leila Nahidiazar (Netherlands Cancer Institute).
chromosomes gert van capellen
Cultured cells with labeling of chromosomes (blue) and exosomes (red; small structures visible in the image on the right). Specimens by Gert van Capellen (Erasmus MC), images by Erik Manders. These images are special, because exosomes are not visible on regular confocal images!
Neuron-Christiaan-Zeelenberg background-corr
Neuron – by Christiaan Zeelenberg (University of Amsterdam)
Neuroblastoma Stan
N1e-115 neuroblastoma cell with CFP-labelled actin. Image by Stan Hilt (Confocal.nl).
Deer Skin Fibroblast Irene Stellingwerf
Indian Muntjac deer skin fibroblast cells, with antibody labeling of nucleus (blue), actin (green) and mitochondria (red). By Irene Stellingwerf (Confocal.nl).

© 2018 Biofotonica srl - p.IVA 01456550530 - www.biofotonica.it info@biofotonica.it
Sede Legale: Via Amedeo Bocchi 300, 00125 Roma Tel: +390681175637 Mob: +393920301676 Fax: +390689280737